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PCR模板的制备

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PCR模板制备是PCR实验的首要步骤,模板制备是从待分析样本中纯化和浓缩核酸(DNA或RNA)以作为PCR扩增模板的过程。由于PCR用途多样,用于提取核酸的材料可能是全血、动植物组织、培养细胞、口腔涂片、体液、甚至是1700万年前到2000万年前的木兰叶化石。对于不同类型的样本,需要利用不同的方法进行核酸提取。下面分别就PCR模板制备的步骤及不同材料的模板制备方法做一介绍

模板制备步骤

模板制备步骤

PCR模板制备指的是从样本中提取核酸的过程,涉及到裂解细胞、蛋白变性、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤,下面分别就这些步骤做一介绍。

裂解细胞

裂解细胞的方法有以下几种:

  • 物理破壁法:超声波处理、研磨法、玻璃珠法等,适用于带细胞壁细胞的裂解,破碎时需液氮冷冻处理增加细胞壁脆性,细胞破碎后需快速加入TE缓冲液并迅速混匀,对细胞溶浆中DNA进行保护。
    (TE缓冲液成分:10mM Tris-HCL,1mM EDTA PH8.0,Tris-HCL的作用为提供一个缓冲环境,防止 核酸被破坏、EDTA的作用为螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;)
  • 化学试剂:SDS、TRIzol(主要用于提取RNA)等。SDS可以促使细胞壁破裂,同时破坏细胞膜结构;TRIzol主要成分是苯酚和异硫氰酸胍,能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
  • 酶解法:溶酶菌、蛋白酶K、蜗牛酶等。蛋白酶K适用所有标本的消化处理,蜗牛酶常用于酶解真菌,溶酶菌可以对细菌进行裂解。
  • 煮沸法:通过煮沸进行细胞的裂解,适用于质粒DNA的提取。
  • 微波法:通过微波加热使细胞裂解,可以用于真菌基因组DNA的提取。

蛋白变性

蛋白变性的目的为使核酸与蛋白质之间的结合键断裂,便于后续去除蛋白质。可以利用SDS等去污剂使蛋白变性,也可利用煮沸的方法使蛋白变性。另外,在苯酚-氯仿抽提的步骤中,苯酚也可以使蛋白变性。

苯酚-氯仿抽提

质粒抽提

苯酚-氯仿抽提的目的为去除细胞裂解液中蛋白、多糖、酚类等杂质,分离核酸。使用苯酚-氯仿溶液处理裂解后的匀浆液,最终核酸分子溶于上层的水相,多糖、酚类等处于下层的有机相,蛋白质则沉淀于两相之间。

在苯酚-氯仿溶液中苯酚的作用是使蛋白变性,同时抑制DNase的降解作用;氯仿是分子量比较大的有机溶剂,使用氯仿作为有机相可以达到快速的和无机相分离的效果。在用苯酚-氯仿抽提核酸时,通常要加入少许异戊醇(苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1),异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡,另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间变性蛋白相及下层有机相溶剂维持稳定。

乙醇沉淀

核酸具有不溶于无水乙醇(准确的说是浓度为66%以上的乙醇)的特性。苯酚-氯仿抽提后取上层水相,加入无水乙醇,轻轻混匀后即出现丝状的沉淀。离心,弃去上清,沉淀即为核酸。最后利用TE缓冲液重新溶解核酸,即可作为PCR的模板。

说明:由于PCR实验对于模板纯度要求并不高,因此不需去除杂质,同样可以PCR的模板。例如对于单细胞的微生物、血细胞或培养的细胞,利用SDS破坏细胞膜结构使DNA释放出来,即可直接作为模板。对于较复杂的动植物组织则添加蛋白酶K进行适当消化,即可达到同样的目的。

常见的DNA模板制备方法

常见的DNA模板制备方法有CTAB法、SDS法、蜗牛酶法、蛋白酶K消化裂解法、碱裂解法、煮沸法、微波法等。不同的方法适合处理的样本种类也有所不同,下面分别就这些方法做一介绍:

CTAB法

CTAB法通常用于植物DNA的提取。CTAB是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜并与核酸形成复合物,该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCL)是可溶的,当降低溶液的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCL)时从溶液中沉淀。
研磨破碎细胞后加入65℃预热的CTAB,通过离心就可以将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中,加入乙醇使核酸沉淀(CTAB能溶解于乙醇中,不会沉淀),最终收集得到核酸。

蜗牛酶法

蜗牛酶法常用于真菌基因组DNA的提取。其原理为利用蜗牛酶裂解细胞,随后经蛋白变性、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤即可得到基因组DNA。

微波法

微波法可以用于真菌基因组DNA的提取。其原理为利用微波加热破碎真菌,并使蛋白变性,随后经苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤即可得到基因组DNA。

蛋白酶K消化裂解法

蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理。蛋白酶K消化液的配方为:

10mM/L Tris-HCL(PH8.0),10mM/L EDTA,150mM/L NaCL,0.5%SDS,100~200ug/ml蛋白酶K(蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,临用时加入消化液中)

在样本中加入蛋白酶K消化液,待细胞裂解后,经苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步骤即可得到模板DNA。

碱裂解法

碱裂解法通常用于从细胞中提取质粒DNA质粒。其原理为将细胞置于强碱性(NaOH)环境,强碱环境使细胞裂解,同时使细胞裂解释放出来的DNA变性,随后用酸性溶液中和使溶液处于中性,质粒DNA将迅速复性,而基因组DNA由于分子巨大难以复性。离心后,质粒DNA在上清中,而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细胞中提取出来。

煮沸法

煮沸法通常用于从细胞中提取质粒DNA。其原理是将细胞悬浮在含有能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100℃使细胞裂解,同时使DNA解链、使蛋白质变性。闭环质粒变性后DNA链彼此不会分离,当温度下降后又会重新形成超螺旋分子。染色体DNA不会复性,离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可以从上清中回收质粒DNA。

RNA模板制备

RNA模板制备通常用TRIzol法,其原理为利用TRIzol试剂裂解细胞,随后经苯酚-氯仿抽提、异戊醇沉淀等步骤即可得到RNA模板。

由于环境中有大量的RNA酶,在RNA操作的过程中要时刻注意避免RNA的降解,如确保操作环境干净无污染,操作时带好口罩、手套,实验所涉及的器材、材料要经彻底处理,确保无RNA酶等,同时需快速操作缩短实验时间以避免RNA的降解。

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