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PCR产物纯化的方法

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在PCR扩增完成后,反应体系中除了DNA片段,还存在离子、dNTP、引物及聚合酶等物质,这些物质会对后续的实验(克隆、测序等)产生不利的影响,需要对产物进行纯化回收。回收DNA片段有两种途径,即直接回收和从凝胶中回收,每种纯化途径都有相对应的试剂盒。

产物直接纯化

在PCR扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测,在条带单一无其他杂带的情况下,可以用产物纯化试剂盒对PCR扩增产物直接进行纯化。目前市面上的产物纯化试剂盒大多是利用吸附柱的方法,其实验过程为“吸附-洗杂-洗脱”:将PCR产物置于DNA纯化柱中,产物中DNA片段会吸附于DNA纯化柱上,利用wash buffer通过一系列快速漂洗-离心的步骤,将引物、核苷酸、蛋白、酶等杂质去除(洗杂需重复多次以尽可能的洗去杂质,提高产物纯度),最后用洗脱液将DNA片段洗脱。

凝胶回收纯化

如果电泳检测结果存在非特异性条带,则需要通过切胶将目的条带分离出来,随后利用胶回收试剂盒对凝胶回收纯化。凝胶回收纯化与产物直接纯化相比多了一个溶胶的过程,两者纯化原理基本相同。

产物直接纯化与凝胶回收纯化区别

产物直接纯化的回收率比胶回收高,但只适用于电泳结果为单一条带的情况。凝胶回收纯化需要先跑胶然后将目的条带切胶回收,纯化产物更纯净。

注意事项

  • 纯化前后都需要进行电泳检测,纯化前电泳目的是验证是否存在目的基因及是否存在非特异性结果,纯化后电泳目的是为了验证是否纯化得到目的基因及计算产物的回收率;
  • 不同纯化试剂盒适用的DNA片段长度会有所不同,购买前建议先仔细阅读说明书。用不适合的试剂盒会影响最终的回收率,甚至无法纯化得到目的DNA;
  • 切胶需在长波长的UV灯(紫外灯)下操作,并且快速操作,避免损伤DNA;
  • 如果PCR的扩增模板为质粒,需要用切胶回收的方式进行纯化;
  • 试剂盒中结合液含有刺激性化合物,操作时要带乳胶手套,避免沾染皮肤、衣服和眼睛;

如何提高回收率?

天线宝宝平特坛论PCR产物纯化回收有两个重要的技术指标:纯度和回收率。回收率不理想会使工作量大大的增加,下面就介绍一些能够提高产物回收率的小技巧:

  • 洗脱液提前在水浴锅中50-60℃预热,同时多次洗脱液可以提高回收率;
  • 一些PCR产物中可能存在石蜡油,石蜡油会导致回收率降低,因此建议清除石蜡油;
  • 使用新配的TAE Buffer作为电泳缓冲液,TBE Buffer或反复使用的TAE Buffer都将影响DNA的回收率;
  • 在电泳时上样孔尽量加满,这样可以在后续切胶过程减少回收胶的重量;
  • 切下带有目的条带的胶块体积越小越好;
  • 切胶后利用胶回收试剂盒回收,凝胶溶解要充分,溶完胶后稍凉一下再上柱,高温条件下DNA不易与柱结合;

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