天线宝宝平特坛论

PCR问题及提高PCR扩增特异性的方法总结

相关技术:PCR标准操作流程

本文根据自身实验经验总结,针对PCR实验过程出现的问题举例,提供可实施的解决方法。并根据经验列举了提高PCR反应特异性的方法。

下载

PCR常见问题分析

问题1:假阴性(无扩增产物)

现象:正对照有条带,样品无条带

可能原因:

  • 模板:含有Taq酶抑制剂、杂蛋白,模板上样量低或模板降解
  • 引物:引物降解,引物设计不合理
  • 试剂:酶失活,buffer不合适
  • 反应条件:退火温度高,延伸时间短

解决方法:

  • 纯化模板并重新提取,并检测模板是否含有抑制剂
  • 重新设计引物并低温保存
  • 优化buffer,摸索镁离子浓度或适当加入DMSO(小于0.3%)
  • 提高退火温度,增加延伸时间(反应条件参照试剂盒说明书)

问题2:假阳性

现象:空白对照出现条带

可能原因:

  • 引物设计不适,与目的序列具有同源性
  • 试剂污染:水、移液枪等被核酸污染
  • 样品间出现交叉污染

解决方法:

  • 实验仪器高压灭菌
  • 实验试剂(酶除外)高压灭菌,离心管枪头一次性使用
  • 规范实验操作
  • 假阳性可通过巢式PCR解决,或者使用特异性较高的试剂盒扩增

问题3:拖尾、弥散

现象:电泳出现拖尾、涂抹带

可能原因:

  • 酶用量过多
  • 模板纯度较低
  • dNTP、镁离子浓度过高
  • 循环次数过多

解决方法:

  • 减少用酶量或使用特异性高的热启动酶扩增
  • 纯化模板
  • 减少dNTP用量,摸索镁离子浓度
  • 减少循环次数

问题4:二聚体及非特异性产物

一般小于100bp的条带可基本判断为引物二聚体

主要原因:

  • 引物设计不合理,引物自身具有互补性
  • 引物浓度不适
  • 镁离子浓度过高,退火温度过低

解决方法:

  • 重新设计引物并进行BLAST检测
  • 降低镁离子浓度,提高退火温度
  • 增加模板用量

提高PCR反应特异性的方法

  1. 引物的设计
  2. 引物最好在模板cDNA的保守区设计,长度15-30bp,GC含量小于60%,3’端不超过连续三个G或C,碱基分布错落有致,避免引物自身形成二聚体,设计完成之后,需进行BLAST检测,如果与其他基因不具有互补性,则可以进行下一步实验。

  3. 降落PCR
  4. 降落PCR是一种简单的降低非特异性产物的PCR,最大的优点就是可以降低实验耗时,同时又可以优化实验的步骤。引物的设计决定退火温度,退火温度过高会使PCR效率过低,过低则会使非特异扩增过多。这虽然可以通过反复尝试来优化,但费时费力。降落PCR提供了一个较为简易的优化方法。首先在较高的温度下扩增,此时虽然扩增效率低,但非特异扩增基本没有。随着退火温度的降低,非特异扩增会逐步增多。但由于此时特异的扩增产物已经达到一定的数量优势,因此会对非特异扩增产生强烈的竞争抑制,从而大幅提高PCR的特异性和效率。

  5. 热启动扩增
  6. 采用热启动方法进行扩增,是除了设计最佳引物之外,提高PCR反应特异性最好的方式。在一般的PCR反应中,试剂的配置需在冰上进行,且要将PCR仪预热,这种方法就类似于热启动,能够一定程度的抑制错配。但是酶在低温下也存在活性,只要体系中有DNA链存在,就会扩增产生非特异性条带。采用热启动的方法就是在达到变性温度之前完全抑制酶的活性,而最有效的方法就是使用热启动酶或高保真酶去扩增,它的原理就是采用化学修饰的方法封闭酶的活性中心,当温度上升到95℃时恢复活性,指导扩增。

  7. 巢式PCR
  8. 采用巢式PCR进行扩增,在多轮扩增结果中提高扩增特异性和灵敏度。与普通PCR不同的是,它采用两对引物进行扩增,首先用第一对引物普通PCR,然后将第一轮扩增的产物稀释100倍后用第二对引物(巢式引物)二次扩增。因此采用巢式PCR可以大大增加困难模板扩增的特异性和有限靶序列的灵敏度。

  9. 合适的琼脂糖凝胶的浓度

琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围

琼脂糖凝胶浓度 DNA分离范围
0.3% 5000-60000
0.5% 1000-30000
0.7% 800-12000
1.0% 500-10000
1.2% 400-7000
1.5% 200-3000
2.0% 50-2000
仅供科研

联系我们

电话:(025)5889-4959

咨询:Sales@new-tennis.com

地址:南京市高新开发区星火路10号

最准平特三连肖论坛 今天香港马报资料 中特内部免费公开 手机看全年开奖记录 香港赛马会六合开奖结果 看图解平特 伯乐相马经 最准平特一肖一码 手机看马会开奖 天线宝宝论坛资料